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LP 層析系統簡明使用教程
發表日期:2012-06-29
 

一、儀器名稱:BioLogic LP層析系統

二、規格型號:BioLogic LP

三、生產廠家:Bio-Rad Laboratories, Inc

四、產品簡介

隨著生命科學研究進入后基因組時代,以蛋白質為主要對象的研究成為各實驗室研究的主題,其中,對單個蛋白質的分離純化是蛋白質研究的基礎工作,也是非常重要的工作。對純度均一蛋白質的研究是揭示生命規律的重要手段,也是新藥研發的必要途徑,因為只有獲得一定量的蛋白質純品,才能滿足結構和功能的分析、物理化學參數測定、生物活性、毒理和藥理實驗等等,乃至大量制備用于診斷和治療。

蛋白質分離純化的重要問題是如何在純化過程中保持溫和的條件,從而保證在此過程中蛋白質的結構和活性不受影響。層析技術(Chromatography)為蛋白質純化提供了這樣的條件,大都在室溫或低溫下操作,所用的流動相可以是與生理液相似的具有一定pH值、離子強度的緩沖水溶液,所用的填料表面修飾各種基團,可與蛋白質分子溫和接觸,從而保持了蛋白質分子的原有構象和生物活性。層析系統以及各種分離純化所需的填料和層析柱是保證該純化過程的穩定性、重現性和自動化進行所必需的設備。

五、技術原理

將一種混合物分成單個組份是一個熵減的過程,故外界必須要給此過程提供能量。如下圖所示,完整的層析系統主要包含泵、各種閥門、層析柱、各種在位檢測器和收集器。

其主要過程是:由蠕動泵推動溶液;各種閥門控制溶液流向,或者進樣,或者洗脫層析柱;樣品經過層析柱并洗脫后,以樣品各組分在流動相和固定相(層析介質)中的分配系數不同而保留不同,從而分開;不同組分經過各種在位檢測器,如紫外檢測器、電導檢測器、pH檢測器等確定各組分的位置和濃度;最后各組分由收集器自動收集。

其中,泵是層析系統的心臟,用以推動溶液流動,LP的泵是雙通道蠕動泵,可提供精確穩定,雙向變速可調的液流,可配不同直徑蠕動管,流速范圍為0.01-40mL/min。檢測器是層析系統的眼睛,必須具有足夠的靈敏度。在層析中需要檢測的指標主要有離子強度,紫外/可見光吸收值,折光度,熒光值等。

層析系統為層析技術及其過程提供了穩定、準確、可靠的自動化平臺,而各種層析介質和層析柱則是層析技術的核心。各種層析技術簡介如下:

1、離子交換(ion exchange chromatography, IEC):利用蛋白質在一定緩沖液和pH條件下不同蛋白質具有彼此不同的電荷數目,從而與離子交換層析介質上的配基的相互作用不同,以不同離子強度或連續離子強度梯度的鹽溶液將結合能力不同的蛋白質依次洗脫下來。蛋白質與離子交換介質之間的相互作用方式是多種多樣的,不僅與蛋白質所帶的凈電荷有關,而且與蛋白質分子的空間結構和電荷分布等因素有關,每一種蛋白質具有其獨特的性質,因此,在分離制備蛋白質時要選擇不同的介質和不同的條件,主要有層析介質及其孔徑和載量,如UNOsphere Q/S,MacroPrep High Q/S, DEAE和CM等,層析條件主要有緩沖液、pH值、離子強度等等。

2、凝膠過濾(Gel Filtration Chromatography,GFC):一種純粹按蛋白質分子在溶液中的體積大小分離的層析方法,層析介質具有一定范圍的孔尺寸,大分子進不去而先流出層析柱,小分子后流出。

3、羥基磷灰石層析(CHT):具有獨特的分離機理,是唯一直接用于蛋白質和核酸純化的無機層析填料,高度耐堿,生物安全性最高。其中PO43-離子與帶正電的蛋白質以離子鍵結合,具有離子交換特性,可由NaCl濃度梯度或磷酸鈉濃度梯度洗脫,其中的Ca2離子與帶負電蛋白質的自由羧基以金屬螯合方式結合,這種結合方式對NaCl不敏感,可由磷酸鈉濃度梯度洗脫。因此該填料既可以用磷酸鈉單梯度洗脫,也可以采用NaCl梯度洗脫后以低濃度磷酸鈉緩沖液平衡,再以磷酸鈉濃度梯度洗脫的雙梯度洗脫模型,以達到更高的分辨率。

4、親和層析(Affinity Chromatography):利用生物大分子和層析介質表面存在的某種特異性吸附而進行選擇性分離的層析技術。層析介質表面預先連接上配基,如Protein A、IDA、酶、抗原、激素等等,具有和配基有生物特性吸附的生物大分子與配基相互作用而被保留,沒有這種相互作用的分子不能保留而先流出層析柱,再改變洗脫液的條件,如pH值、組成等,把吸附在層析柱上的蛋白質分子以純品或較純的形態洗脫下來。

5、疏水作用層析(hydrophobic interaction chromatography, HIC):蛋白質分子時一個外部有一親水層包圍、內部有疏水核并具有高級結構的復雜體系。盡管蛋白質表面親水性很強,但也存在一些非極性的疏水基團或疏水區域,特別在高濃度鹽溶液條件下,這些疏水基團向外伸展,可以和層析介質上的疏水配基相互作用,不同蛋白質的疏水特性不同,從而可以在不同鹽溶液下實現不同的保留而被分離。通常疏水層析以高濃度鹽溶液平衡上樣,洗脫過程中鹽濃度下降,蛋白質與層析介質上的配基的吸附力變為排斥力,從而蛋白質被洗脫。

六、結構組成


七、儀器操作

1、 將儀器電源打開,預熱。

2、 緩沖液配制:根據所用層析方法和條件配置溶液,如果方法中要用到梯度洗脫,需配置A液和B液,分別將混合器的A、B管浸入到相應的溶液中,如圖:

3、   沖洗管道系統:

在做實驗之前,必須采取合適的步驟以排除導管中的氣泡。

將A液及B液按右圖放置到位。 

A)確認未接層析柱。并將層析柱進口管與出口管對接。按下“Purge”按鍵,泵將以最大流速沖洗整個管道系統。

B)在泵運行時輪換按下“Buffer”鍵,讓所有緩沖液進口管道都充滿緩沖液然后將泵停下。

C)將流速調節到相對層析柱為安全的流速,接入層析柱,按下“Run”鍵,將可能進入柱子的氣泡排除。

 

 

B)手動模式平衡層析柱:按模式鍵的Manual,再按組件設置鍵的Pump,則顯示屏顯示泵主界面如下:

 

按Flow下的功能鍵進入流速設置界面,如下圖:

用數字鍵輸入制定流速,按OK確定回到泵主界面,再按Start下的功能鍵開始以所設定的流速平衡層析柱,檢查電腦軟件中色譜圖的UV基線。

如果要以A、B兩種溶液以一定配比平衡或沖洗層析柱,則在上述泵主界面按Buffer下的功能鍵進入溶液混合界面:  

4個功能鍵,具有顯示屏當前所顯示的功能  

各組件指示燈,表示當前組件的狀態

模式切換鍵,用于切換手動、程序編輯、程序運行3中模式  

組件設置鍵,用于設置各組件,包括泵、收集器、警報、UV、電導、閥門和記錄儀等各參數

光標移動鍵,用于選擇顯示屏的光標位置所在的選項

色譜圖標記鍵,用于在色譜圖當前位置做標記  

數字鍵,輸入設定值

 

按Mix下的功能鍵進入

界面,光標移至Enter mixture后,輸入B液的百分比,按OK下功能鍵確定并回到泵主界面,按Start下功能鍵開始沖洗或平衡層析柱。

5、方法編輯:一個完整的LP層析方法由3部分組成:泵步驟表、收集器表和警報器表,3個表各自編輯,保存后儀器自動將3個表按時間順序整合到一個完整的方法中。具體如下:

    A)泵步驟表編輯:

按Program模式鍵進入方法編輯界面;

選擇New Method,進入方法步驟編輯界面并選擇時間模式;

進入步驟編輯界面:

,按ADD下的功能鍵增加泵步驟,根據具體的層析方法編輯各個步驟,例如該儀器的Startkit,用標準樣品走High Q強陰離子交換柱,用Previous/Next鍵選擇Buffer A,按OK,輸入步驟長度為3min,按OK確定,輸入流速為1.5mL/min,按OK確定,這時已經編好了泵步驟的第一步,再按ADD依次繼續編輯泵步驟表如下:

第二步:0%-50%B的梯度,10min,流速1.5mL/min;

第三步:Buffer B,6min,流速1.5mL/min;

第四步:Buffer A,6min,流速1.5mL/min;

第四步編輯完畢后按OK確定,回到方法主界面。

B)警報表編輯:

按Alarm下的功能鍵,按ADD,進入界面

,Alarm 1輸入時間為3min,Hold設置為No。按2次OK確定。

設置該步后,方法運行后3分鐘警報器響,這提醒你必須將手動進樣閥切換到Load位,使梯度步驟的緩沖液直接流到層析柱中,而不是流到進樣環里。

C)收集器表編輯:

在方法編輯主界面按Frac Coll下的功能鍵,進入

界面,選擇All,進入

,輸入收集體積為2mL,按2次OK,確定并回到方法列表界面,選擇DONE,再按Save鍵,輸入方法名為Demo1,按DONE確定。

6、方法運行

1)將MV-6手動進樣閥按逆時針方向轉動到底

2)用針筒吸取2mL標準蛋白樣品,插入到MV-6手動進樣閥頂部的進樣口,將樣品打入到進樣環中,并將針筒留在進樣口,不得拔出,否則樣品將從廢液管流出。

3)運行前檢查:

   A)檢查手動狀態下平衡柱子的情況,基線是否平衡,系統管道各處是否有氣泡,如果有,必須對管道進行Purge;

   B)按組件設置鍵設置檢測器:按UV,設置Range為0.05AUFS,ReZero基線調零;電導檢測器的最大和最小值應滿足B液和A液的電導值,可設置最小值為0,最大值為200mS/cm;

   C)按Program模式鍵,選擇View Method檢查所編輯的方法步驟是否與所設計的一致;

   D)檢查組分收集器是否連接,并將收集器的第一管對準滴頭下方。

4)運行方法:

A)按Run模式鍵,系統倒計時10秒后開始運行方法;同時點擊軟件工具欄的Log On按鈕開始記錄。

B)方法一開始,將手動進樣閥轉到最右邊,開始進樣,當警報響時,進樣結束,將手動進樣閥轉到最左邊。

7、運行后數據處理

   

八、注意事項

 

九、儀器部分組件校正

泵的校正:注意,校正泵流速前必須確保管道無任何氣泡,并將泵進水管浸沒到溶液或水中,用干凈精確的小量筒接出水管道泵出的溶液或水。

按模式鍵的Manual,再按組件設置鍵的Pump,則顯示屏顯示泵主界面如下:

 

按Flow下的功能鍵進入流速設置界面,如下圖:

 

按Calibrate下的功能鍵,進入泵校準界面,

 

選擇泵蠕動管直徑,標準管可直接按各自直徑下的功能鍵,泵開始倒計時流動,倒計時結束時出現

界面,如果流速正常,按Nominal,如果有偏差,則按Set Flow進入

,輸入泵出的正確體積,按OK確認。

  

 

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