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PDS-1000臺式基因槍操作流程
發表日期:2012-06-29

一.PDS-1000臺式基因槍操作快速指南(在使用基因槍操作前,建議首先不使用微載體和靶細胞進行一次“dry run”,測試基因槍的氣體通路一切正常后再進行實驗)

轟擊前的準備工作

1.實驗前清洗與滅菌(高壓蒸汽滅菌)處理:破裂盤固定帽、微載體組件、載體膜及載體膜支架、終止屏

2.采用70%乙醇對PDS-1000臺式基因槍腔體進行滅菌處理并晾干。

注意:不要對腔體進行高壓蒸氣或加熱等滅菌處理,這樣會毀壞PDS-1000臺式基因槍

3.洗滌微載體并儲存于50%的甘油,具體洗滌步驟如下(按下面步驟得到的微載體可進行120次轟擊實驗,每次轟擊使用約500ug的微載體)

a)  稱取30mg微載體,將其放入1.5ml的離心管內

b)  在離心管內加入1ml 70%乙醇

c)  在渦旋混合器上充分震蕩3~5分鐘

d)  震蕩結束后靜置15分鐘

e)  將上述含有微載體的70%乙醇溶液離心約5秒鐘,棄上清

f)   在得到的微載體沉淀中加入1ml蒸餾水

g) 充分震蕩1分鐘

h) 震蕩結束后靜置1分鐘

i)   將上述含有微載體的水溶液大致離心后棄上清,再重復f~i的步驟2次

j)   在得到的微載體沉淀中加入500ul經滅菌的50%甘油(如忽略上述洗滌步驟中的損耗,微載體的濃度為60mg/ml)

        注意:a)上述制備得到的微載體甘油溶液在室溫下可保存2周;b)如為鎢粉載體,建議在-20°C條件下儲存避免氧化,而金粉載體可在4°C或室溫下儲存

4.在實驗的當天用外源DNA分子包埋微載體,具體包埋步驟如下(按下面步驟得到的微載體可進行6次轟擊實驗,每次轟擊使用約500ug的微載體)

a)從上述微載體儲存溶液中吸取50ul(3mg)的微載體加入1.5ml的離心管內

注意:從微載體儲存溶液中吸取微載體時,需將微載體儲存管放置在渦旋混合器上持續地、充分的震蕩,因為這樣才能避免微載體之間形成聚合體從而使DNA均勻地包埋在微載體的表面

b)加入5ul DNA(1ug/ul)

c)加入50ul 2.5M CaCl2

d)加入20ul 0.1M 亞精胺,持續震蕩2~3分鐘

e)震蕩結束后靜置1分鐘后離心約2秒鐘,棄上清

f)在得到的沉淀中加入140ul 70%乙醇(HPLC級或分光光度計級),離心棄上清

g)在得到的沉淀中加入140ul 100%乙醇,離心棄上清

h)在得到的沉淀中加入48ul 100%乙醇,輕輕地拍打離心管管壁數次后,在低速的混合器上充分震蕩2~3秒鐘

5.將包埋得到的微載體放置于載體膜(Macrocarrier)及載體膜支架(Macrocarrier Holder)。首先準備一個帶蓋的經滅菌處理的60mm組織培養皿,在其底部鋪上一層CaCl2作為干燥劑,并在CaCl2上放一張濾紙;然后將載體膜及載體膜支架放在濾紙上,不銹鋼的載體膜支架與濾紙接觸而載體膜向上;最后用微量移液器吸取6ul(約500ug的微載體)經包埋處理的微載體水平地涂在載體膜中央直徑約1cm的范圍內,完成鋪涂后立刻蓋上組織培養皿的蓋子約10分鐘,使乙醇揮發。(具體操作如下圖所示)

注意:a)為確保實驗結果建議使用最新包埋好的微載體;b)上述操作需在一個平穩的工作臺上進行以避免震動引起微載體互相凝結;c)在吸取微載體時還需將經包埋處理的微載體儲存液放置在渦旋震蕩器上;d)上述操作制備得到的載體膜及載體膜支架在2小時后即不能使用,需重新制備。

6.將破裂盤放置到位。首先用經過滅菌處理的鑷子取出破裂盤并在70%異丙醇液體內輕蘸幾下進行滅菌;然后將上述處于濕潤狀態的破裂盤放置在破裂盤固定帽內;最后將上述含有破裂盤的破裂盤固定帽連接到基因槍腔體內的氦氣氣體加速管(gas acceleration tube)上,并用扳手擰緊。(具體操作如下圖所示)

注意:a)取破裂盤必須使用經過滅菌處理的鑷子,因為油脂、指紋以及手套上的粉末都會造成破裂盤與破裂盤固定帽之間不能緊密結合從而導致漏氣;b)在對破裂盤進行滅菌處理時不要將破裂盤長時間的浸在70%異丙醇內,否則會造成破裂盤的脫層;c)當破裂盤固定帽內沒有放入破裂盤時不要與氦氣氣體加速管擰緊,避免二者的金屬表面由于刮擦而引起漏氣;d)不能對破裂盤進行高壓蒸汽滅菌

 

 

7.根據具體的實驗條件調節破裂盤和載體膜之間的位置,最后放置終止屏

注意:在進行轟擊前確認在微載體組件內放置了終止屏,否則靶細胞會由于高速的微載體和載體膜而受到損傷

8.檢查氦氣瓶的壓力,氦氣瓶的壓力需要超過具體破裂盤對應壓力200 psi(如使用900 psi規格的破裂盤,那么氦氣瓶的指示壓力必須為1100 psi)

9.將待轉染的靶細胞或組織放在臺式基因槍腔體內特定的位置上,關門

轟擊的流程

1.確認PDS-1000臺式基因槍電源線連接完好,按下紅色的“Power Switch ON/OFF”鍵開機

2.按下“Vac/Vent/Hold Switch”鍵設置在VAC檔位對臺式基因槍腔體抽真空,并維持在特定的真空度水平上(真空度至少為5英寸高的水銀汞柱),達到最低的真空度時最右面的“Fire Switch”鍵的指示燈會閃爍。當達到設定的真空度時,迅速地將“Vac/Vent/Hold Switch”鍵設置在HOLD檔位維持該真空度

3.按住“Fire Switch”鍵直到破裂盤破裂、氦氣壓力表顯示為零才釋放“Fire”鍵(具體操作如下圖所示)

注意:a)在破裂盤破裂前釋放“Fire Switch”鍵實驗失敗;b)在破裂盤破裂后長時間不釋放“Fire Switch”鍵導致氦氣的浪費;c)破裂盤破裂時會有輕微的響聲,此時觀察臺式基因槍上方的氦氣壓力表就可以知道破裂盤破裂所需的具體壓力;d)當壓力達到設定值的90%左右時,破裂盤破裂所需的時間大致為11~13秒。

轟擊后儀器的維護

1.按下“Vac/Vent/Hold Switch”鍵設置在VENT檔位停止對臺式基因槍腔體抽真空;

2.當臺式基因槍真空度顯示為0時打開腔體門將實驗細胞或組織從腔體內取出;

3.將微載體組件(microcarry launch assembly)拿下,丟棄載體膜及終止屏;

4.取下破裂盤固定帽(rupture disks retaining cap)上使用后的破裂盤(rupture disks);

5.關閉氦氣瓶閥門。

 

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