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H1N1流感病毒整體解決方案
發表日期:2012-06-26
 

一.病毒RNA樣品提取

 Real-time RT-PCR實驗的第一步是獲得純凈的RNA樣品,檢測H1N1病毒的呼吸道樣本包括支氣管肺泡灌洗液、氣管抽吸物、痰、鼻咽或口咽洗液或拭子。而在流行病爆發時,能夠對大批樣品進行快速而安全的提取非常重要。ThermoFisher公司的KingFisher系列自動化磁珠提取純化儀器,聯合Ambion等公司的病毒RNA磁珠提取試劑盒,可以用于從多種來源的樣本中,如血清、血漿、口腔拭子和細胞培養液中,提取病毒RNA。該系統不需有機溶劑或RNA沉淀步驟,消除了基于濾膜的方法經常碰到的問題,如濾膜堵塞、大的洗脫體積和不穩定的產率。KingFisher可以讓操作人員免去很多繁瑣的手工操作,并且遠離病毒及有毒試劑的危害。而結合后續的實時定量RT-PCR,可儀檢測到低至10拷貝的病毒RNA,可極大提高H1N1亞型豬流感病毒檢測的靈敏度。

    此技術經過美國國家獸醫服務實驗室(NVSL)驗證,是美國農業部認可的禽流感檢測的分子生物學方法。目前,日本的國立傳染病研究所剛剛購買了4臺新推出的Kingfisher Flex,應用于流感病毒RNA的純化。韓國的Catholic University 也剛剛采購了Kingfisher mL用于病毒RNA的應用。越南的Kingfisher安裝在世衛組織(WHO)的實驗室。中國農業部獸醫診斷中心、哈獸研動物流感參考實驗室、北京出入境檢驗檢疫局 等單位,以及澳大利亞和新西蘭的Kingfisher系統也主要應用于這方面的工作。

 

 

 

 

 

 

 

Kingfisher磁珠純化家族

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


二.Real-time RT-PCR檢測

 Real-time RT-PCR是目前最快速最靈敏的病毒檢測方法之一,也是《甲型H1N1流感病毒實驗室檢測方法》中推薦使用的方法。Real-time RT-PCR檢測豬流感的方案是用一組寡聚核苷酸引物和Taqman探針,對呼吸道樣本或體外培養的豬流感病毒進行檢測鑒定。InfA引物和探針為檢測出甲型流感病毒而設計,swInfA引物和探針可特異性地檢測出所有的豬甲型流感病毒,swH1引物和探針可特異性檢測豬流感病毒H1亞型。因為實驗材料是RNA,所以推薦使用一步法反轉錄熒光定量PCR試劑盒。

美國Bio-Rad作為全球分子生物學實驗室設備領域的領先者,對于流行病致病菌和病毒的檢測一直非常關注。美國CDC/WHO 關于豬流感檢測的文獻和操作方法中,使用了Bio-Rad的一步法熒光定量PCR試劑盒iScript One-Step RT-PCR Kit,及Bio-Rad的熒光定量PCR儀。

美國Bio-Rad的CFX96 實時定量PCR儀,能夠為使用者提供可靠的溫度控制特性、最先進的光學檢測技術和功能強大的軟件控制及數據分析能力,能夠得到精確的定量結果,準確區分目標基因。為研究者提供最佳的實時定量PCR結果。

 

CFX96 Touch實時定量PCR儀的主要特點

       

 n      結果可靠——光源和檢測器采用一體化的光梭,長壽命的LED和光敏二極管整合在一起,確保實驗結果可靠;                           

n        快速得到實驗結果——光學系統出廠時即經過嚴格校正,

儀器即插即用,能夠在數分鐘內完成安裝,開始實驗

n        縮短實驗運行時間——快速的升降溫速度,

能夠在30分鐘內完成定量PCR 實驗

n        快速優化實驗條件——溫度梯度功能能夠在一次實驗中既能找到最優化的實驗條件

n        減少實驗樣品和試劑的消耗——10 μl反應體系即能得到穩定可靠的實驗結果

n        根據實驗需要選擇數據采集方法——支持SYBR Green 快速掃描模式

n        隨時隨地分析實驗結果——軟件能自動通過電子郵件將實驗結果作為附件發送

n        提高檢測通道——一臺電腦能夠控制多大4臺CFX96 Touch 實時定量PCR 儀

 

 

 

 

 

 

美國Bio-Rad的一步法熒光定量PCR試劑盒iScript One-Step RT-PCR Kit,融合了iScript反轉錄酶系統和iTaq熱啟動DNA聚合酶系統,非常適用于病毒的快速檢測,是美國CDC2007年推薦的檢測豬流感的標準Protocol中采用的試劑盒。

iScript One-Step RT-PCR Kit的主要特點:

n        可兼容所有雜交探針進行靈敏和特異性的RT-PCR

n        線形動態范圍從100fg到100ug,使客戶的實驗設計

具備很大的靈活性,可靠檢測低拷貝的目標序列。

n        整個試劑盒只有優化過的三管成分,操作簡便。

流水線化的反應組裝程序,有效減少實驗操作和試劑分裝步驟中引入交叉污染的幾率。

n        獨特的低起泡配方,減少加樣過程中帶來的氣泡,使高通量和自動化實驗中的組裝步驟變簡單。

n        經驗證,可對樣品中拷貝數接近的兩個目標序列進行同時檢測。

 

三.樣品操作與保存

《甲型H1N1流感病毒實驗室檢測方法》中要求樣品處理要在生物安全實驗室完成。生物安全實驗室需要配備相應的生物安全柜對實驗室環境、操作人員及樣品進行?;?。美國熱電 Thermo Fisher旗下的 A2/B2型生物安全柜是世界上最好的生物安全柜,在國際上享有很好的盛譽。美國熱電的生物安全柜(包括部分棑和全棑)都,達到Class 2等級,工作區氣流潔凈度達100級。此外,同屬Thermo Fisher旗下的Forma系列-80℃超低溫冰箱能夠為樣品提供最好的保存環境與?;?,Forma系列液氮罐更可以用于有生物危險性的樣品的運輸。

 

 

 

 


豬流感實驗室裝備設備

 

一、生物防護設備

設備名稱

技術規格

數量

單價

推薦品牌

備注

100%排

二級生物安全柜

用途:生物安全操作的平臺

B2型 (100%外排)

1、※ 通過美國NSF/ANSI49安全標準,列入UL.

2、※采用雙風機和直流無碳刷電機驅動。

3、※ 主動氣流調控模式,不用調節閥門即可自動調節氣流,對操作者更安全。

4、UV燈可編程定時,自動熄滅;定時范圍從0小時到24小時。

5、高效HEPA過濾器,針對0.3um顆粒,過濾效率高于99.999%。

6、內部工作區域(W×H×D)mm:≥1232×742×648

配置:

1、主機(含雙HEPA過濾器和雙風機) 1臺

2、可調高度支架 1臺

3、搭手架  1套

4、紫外燈管  1支

5、外排管道和風機  1套

3-4臺

13萬

美國Thermo

 1316型

要求原裝進口

WHO推薦

 

30%外排

二級生物安全柜

用途:生物安全操作的平臺

A2型 (30%外排,70%循環)

1、※ 通過美國NSF/ANSI49安全標準,列入UL.

2、※采用雙風機和直流無碳刷電機驅動。

3、※ 主動氣流調控模式,不用調節閥門即可自動調節氣流,對操作者更安全。

4、UV燈可編程定時,自動熄滅;定時范圍從0小時到24小時。

5、高效HEPA過濾器,針對0.3um顆粒,過濾效率高于99.999%。

6、內部工作區域(W×H×D)mm:≥1200×780×495

配置:

1、主機(含雙HEPA過濾器和雙風機) 1臺

2、可調高度支架 1臺

3、搭手架  1套

4、紫外燈管  1支

2-3臺

7.5萬

美國Thermo

 1356型

要求原裝進口

WHO推薦

 

防護設備

 

 

 

3M

 

 

二、樣品提取和檢測設備

設備名稱

技術規格

數量

單價

推薦品牌

備注

磁珠核酸純化分選系統

用途:特殊設計的分離提取核酸、蛋白及細胞的自動化系統

1、※ 專利的KingFisher技術,通過轉移磁珠的方式來轉移樣品,絕無交叉污染。使用安全和高質量的結果。

2、每純化15個樣品只需15-30分鐘

3、※ 開放的試劑平臺,適用于所有國外和國內試劑

4、處理樣品體積:50-1000uL

5、磁珠收集效率:>95%

配置:

1:KingFisher ml主機

2:程序BindIt軟件

3:KingFisher ml tip comb  磁套  800個

1-2臺

24萬

美國Thermo

KingFisher ml型

要求進口

 

流感病毒RNA的純化(美國農業部指定檢測禽流感設備)

高通量

全自動磁珠分選系統

KingFisher Flex型高通量全自動磁珠分選系統

(特殊設計的分離核酸、蛋白及細胞的自動化系統)

1.※ 所有的純化和處理步驟均在同一微孔板(管)中進行。每純化96個樣品只需15分鐘。

2.※ 轉移磁珠,而非溶液,使用安全和高質量的結果

3.工作容量:96個樣品/次

4.處理體積:20–1000 μl

5.收集效率:> 95%

6.磁棒類型:一體化96根磁棒,磁頭可更換

7.板類型:96孔深孔板,96孔PCR板,96孔KingFisher板

8.磁珠最適尺寸:0.8-10um

9.預先設定的優化的純化程序,100個內置程序

10.能與自動液體處理系統和機械臂兼容,實現自動化操作。

1臺

68萬

美國Thermo

KingFisher Flex型

要求進口

 

流感病毒RNA的純化(美國農業部指定檢測禽流感設備)

RNA提取試劑

病毒RNA磁珠提取試劑盒

MagMAX?-96 Viral RNA Isolation Kit

一批

 

美國Ambion

配合ThermoFisher磁珠純化系統使用

 

定量PCR儀

基因定量擴增儀

型號:CFX96 Touch型

 

激發光源:6個 LED

檢測器:6個PDT

動力學線性范圍:10個數量級

靈敏度:能檢測單拷貝模板

檢測系統特點:光路相對固定;各通道獨立檢測,避免通道間的干擾;96孔逐孔掃描,避免孔間干擾。 

升降溫速率  5 ℃/秒

溫度范圍:0 - 100℃

準確性:±0.2℃

均一性:±0.4 ℃

溫度梯度功能選擇范圍:30-100℃

溫度梯度范圍  1 - 24℃

1臺

60萬

美國Bio-Rad CFX96Touch型

 

 

定量試劑及耗材

1.iScript? One- Step RT-PCR Kit 一步法定量RT-PCR試劑盒

可使用RNA通過熒光定量PCR方法快速檢測出病毒含量及基因表達量

2.PCR反應管、8聯管、96孔板等。

一批

 

美國Bio-Rad

美國CDC2007年推薦的檢測豬流感的標準Protocol中采用了該試劑盒iScript one step RT-PCR   kit

 

梯度PCR儀

用途:病毒DNA擴增

基因擴增儀

型號:S1000型

 

1、加熱速率:5℃/sec

2、溫度范圍:0-100℃

3、梯度溫控范圍:30-100℃

3、梯度溫差范圍:1-24℃

4.在線可儲存多于1000個反應程序文件

5.樣品載量:96×0.2ml

1套

8萬

美國Bio-Rad S1000型

 

要求原裝進口

 

全自動電泳

用途:快速基因檢測

蛋白檢測范圍:10-260KD

RNA檢測范圍:100-6000bases

DNA檢測范圍蛋白檢測靈敏度:2.5ng/ul (CAII)

總RNA檢測靈敏度:5ng/ul(標),100pg/ul(高)

mRNA檢測靈敏度:25ng/ul(標),200pg/ul(高)

DNA檢測靈敏度:0.1ng/ul

1臺

30萬

美國Bio-Rad Experion型

DNA、RNA、蛋白檢測

凝膠成像儀

用途:用于核酸凝膠的成像

1、靈敏度:0.1ng EB染色的DNA

2、動力學范圍>3個數量級

3、最大膠面積:25 x 26 cm, 適合各種尺寸的凝膠。

配置:

1、  凝膠成像主機 1臺

2、  白光轉換屏 1塊

1臺

13萬

美國Bio-Rad Gel Doc XR型

 

全自動酶標儀

用途:用酶聯免疫方法測定物質含量

1、波長范圍:400nm-750nm

2、※讀數范圍:0-4.0A

3、重復性:CV<0.2%

4、讀板速率:5秒/板

配置:

1、主機(含:405、450、492、630nm濾光片) 1臺

2、彩色噴墨打印機 1臺

3、彩色可調移液器 2個

2-3臺

5.6萬

美國Bio-Rad 680酶標儀,  美國Thermo

Muiltiskan MK3型

酶免方法檢測

熒光/化學發光分析儀

用途:鑒于濾光片熒光化學發光法進行核酸蛋白定量

l        2合1熒光/化學發光分析技術,在同一個程序中可進行二種技術的檢測。

l        最新的高性能、高靈敏度的光學系統,狹窄光束直徑1.5mm;檢測低至每孔2 fmol的ATP,測量線形范圍多至7個數量級以上。

l        ※ 快速檢測功能,檢測速度:測定96孔板最低時間為15秒。

l        ※ 加樣量從1ul-1000ul, 1ul增量,很小的管內死體積。

l        ※1個內置進樣器

l        標配的圓周振蕩器,直徑和速率可調,確保有效混勻和加速反應時間。

l        適用1-384孔板型,也可為特定的板型編程。

1臺

35萬

美國Thermo

Fluoroskan Ascent FL型

熒光/化學發光方法檢測

全自動分液器

用途:精確快速的分液,配合純化系統、酶標儀洗板機、熒光化學發光儀、疊板機等使用的自動化設備

1、板型:6-1536孔板

2、分液體積:0.5-2500nl

3、分液速度:3s/10ul, 4s/20ul, 10s/100ul(96孔板)

4、分液精度:0.5ul: CV≤10%

1臺

19萬

美國Thermo

Multidrop Comi/SMART型

自動化精確快速的分液

自動洗板機

用途:與酶標儀配套使用

1、具有圓周震蕩、自動沖洗和預洗功能

2、快速的雙排洗頭系統

3、可自動切換和分液

3、殘液量:平均每板每孔〈1ul

配置:

1、主機   1臺

 (包括雙排16道和雙排24道洗頭)

2、2L洗瓶和2L廢液瓶各一個

1臺

9.8萬

美國Thermo

龙族幻想手游交易模式:Wellwash

龙族幻想内测在哪获得 www.wofcn.icu AC型

輔助設備

快速疊板機

用途:自動化處理微孔板設備,配合純化系統、酶標儀洗板機、熒光化學發光儀、疊板機等使用的自動化設備

1、高通量分液,每小時處理量達300塊

2、板容量:225/150塊

3、符合CE; CSA; UL 認證標準

1臺

29.8萬

美國Thermo

RapidStak 2X型

輔助設備

小型高速離心機

(含生物防護轉頭)

用途:生物樣品的濃縮和制備

1、※ 最高轉速: 14800rpm

2、※ 最大離心力:21000xg

3、專利技術的‘ClickSeal’防生物污染轉頭蓋(CAMR認證)

配置

1.  主機一臺

2.   24×1.5/2.0ml 防生物污染角轉子1套

( 同時可以離心過濾管 )

4-5臺

3.5萬

美國Thermo

Pico21型

樣品的濃縮和收集

小型高速離心機

(含生物防護轉頭)

用途:生物樣品的濃縮和制備

1、※ 最高轉速: 14800rpm

2、※ 最大離心力:21000xg

3、專利技術的‘ClickSeal’防生物污染轉頭蓋(CAMR認證)

配置

3.  主機一臺

4.   24×1.5/2.0ml 防生物污染角轉子1套

( 同時可以離心過濾管 )

4-5臺

3.5萬

美國Thermo

Pico21型

樣品的濃縮和收集

臺式冷凍高速離心機

(含生物防護轉頭)

用途:大量生物樣品的濃縮和制備

1、※ 最高轉速: 15000rpm

2、※ 最大離心力:21890 xg

3、最大容量:  4×100 mL

4、離心時間控制:0-9小時59分或連續離心

   溫度控制:-9~ 40℃

配置:

1、 主機 一臺

2、 24×1.5/2.0 ml角轉頭  1套

(最大轉速/離心力:15000rpm/21890xg)

3、 6×50 ml角轉頭  1套

(最大轉速/離心力:8500rpm/10015xg)

2臺

9.8萬

美國Thermo

Primo R型

樣品的濃縮和收集

全能臺式高速

冷凍離心機

(含生物防護轉頭)

用途:滿足所有生物樣品的濃縮和制備

1、※ 最高轉速: 23300rpm

2、※ 最大離心力:50377 xg

3、最大容量:  4×180 mL

4、加減速控制:9級加速控制/9級減速控制

5、離心時間控制:0-9小時59分或連續離心

   溫度控制:-9~ 40℃

6、驅動系統:無碳刷免維護電機驅動,采用落地式離心機使用的高性能的“Spindle”驅動系統

配置:

1、主機 一臺

2、24х1.5/2.0ml固定角轉子 1個

最高轉速/最大離心力: 23300rpm /50377 xg

3、8×50 ml角轉頭  1套

最高轉速/最大離心力: 15000rpm /26920g

(包含6.5ml、16ml離心管適配器各8個)

4.微孔板轉子  1套

(可放置2×2標準板或2×1深孔板)

1-2臺

19.8萬

美國Thermo

Biofuge Stratos型

樣品的濃縮和收集

 

 

 

三、細胞培養和儲存設備

設備名稱

技術規格

數量

單價

推薦品牌

備注

高溫滅菌

CO2培養箱

用途:生物腫瘤細胞等的培養

1、※ FDA;SFDA認證

2、內置獨特100%HEPA空氣過濾系統,每分鐘持續過濾箱內空氣

3、四周直熱式;內部容積:184.1L

4、※ 140度的高溫滅菌功能。

配置:

1、184.1L主機 一臺

2、不銹鋼帶孔擱板 四塊

3、3升增濕水盤    一個

4、100%HEPA空氣過濾器  1個

2-3臺

5.5萬

美國Thermo

371型

要求原裝進口

 

-86℃超低溫冰箱

(雙門雙鎖安全設計)

用途:生物樣品的保存

1、※美國FDA頒發的CFG證書;歐洲CE,中國SFDA證

2、溫度范圍:-50℃~-86℃

3、內容積:≥360L

4、兩臺1HP密封高效壓縮制冷機。

5、獨立雙外門

6、※全自動高低電壓補償:采用Boost/Buck變換器。

配置:

主機一臺

(含四內門、加熱真空減壓閥、單手操作門鎖)

3臺

7萬

美國Thermo

991型

要求原裝進口

-196℃液氮儲存箱

用途:生物樣品的長期儲存

1、 液氮容量:≥47. L

2、 靜持續(天):120

3、 材質為真空絕熱的輕質鋁材構造

4、 容量:750個2ml凍存管

主機(含6個提桶)

3臺

5.5萬

美國Thermo

CMC8038型

要求原裝進口

 

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